Valoración de Fármacos. De la intuición de Fleming al elegante E-test

«Sorprendentemente, los fundamentos del método de valoración son los mismos que los diseñados por Fleming hace 75 años para la penicilina. De alguna manera, los estudios con lisozima habían sido similares diez años antes.»

Cuando un enfermo padece un proceso carencial, hipertensivo, hepático etc. el médico le receta el suplemento correspondiente, el antihipertensivo que corrija la alteración clínica, a ser posible a nivel de la fisiopatología, o el protector hepático.

El fármaco es administrado acto seguido y.. a esperar. Si no cura el enfermo, se intenta confirmar el diagnóstico, se ajustan las dosis, o se sustituye por otro fármaco.

¿Alguien se imagina que hubiera que someter al fármaco en todos los casos a una valoración en el laboratorio, comprobando su actividad?.

Pues, salvo los casos de tratamiento empírico, es lo que debe hacerse con los antibióticos. Un enfermo con una infección urinaria por ejemplo, debe esperar teóricamente a la realización de un cultivo, identificación del agente causal, y un antibiograma para conocer qué antibiótico debe elegirse. Este complejo proceso en la práctica clínica suele simplificarse aunque con frecuencia es inevitable recurrir a la valoración del antibiótico en el laboratorio. Pero ¿cómo se valora?

Sorprendentemente, los fundamentos del método de valoración son los mismos que los diseñados por Fleming hace 75 años para la penicilina. De alguna manera, los estudios con lisozima habían sido similares diez años antes.

Fleming, tras verificar la difusión de la penicilina en agar, ideó el siguiente método: sobre la superficie del agar, en una placa de Petri, hizo un canal sobre el que colocó una tira de agar impregnado de penicilina. Después sembró varios gérmenes en estría perpendicular a la tira de agar. Los que crecían desde el borde de la tira eran resistentes, los otros sensibles. Como las tiras las obtenía de placas donde había mezclado el agar y la penicilina a diluciones progresivas, en cada placa, disponía así de numerosas tiras con concentraciones diferentes.

Este método lo simplificaría aparentemente Heatley, utilizando cilindros de vidrio con penicilina desde los que difundiría la penicilina al medio. El mayor avance lo aportan Vincent y Vincent, que en 1941 sustituyen los cilindros de vidrio por discos de papel de filtro saturados con la solución problema de penicilina. El diámetro del halo de inhibición sobre Bacillus subtilis permitía su titulación. Sigue siendo el método utilizado para la mayoría de los antibióticos. Pero además, a concentración fija y sembrando un patógeno problema sabremos si este es sensible o resistente. Es el método disco placa, que se sigue utilizando tal cual como antibiograma.

En 1943, Foster y Woodruff describen el método de diluciones progresivas de penicilina en caldo donde, tras sembrar el Staphylococcus aureus se hace la titulación. A concentración conocida de penicilina, tras sembrar una bacteria problema se obtiene la concentración mínima inhibidora (CMI). Este método también se sigue utilizando actualmente.

Otros intentos con dudoso éxito se describieron después con bacterias coloreadas, hematíes como indicadores, métodos turbidimétricos etc. Fleming posteriormente participó como asesor para definir la U. Internacional de penicilina lo que avalaría su autoridad en los procesos de valoración de actividad de antibióticos.

En la actualidad se han sofisticado los procedimientos, especialmente los sistemas automatizados. Pero para la rutina de pocas muestras, y para investigación y control, siguen siendo fundamentales los métodos disco-placa.

Salvo algunas variantes que raramente se utilizan, los métodos de que disponemos hoy día in vitro son las técnicas de difusión y los de dilución. En el primer caso, el antibiótico desde un disco de papel de filtro difunde a la superficie del medio previamente sembrado con el microorganismo problema. En el segundo, el antibiótico a concentración progresiva se incorpora al medio (sólido o caldo) en el que se siembra después el microorganismo problema. Con el primer método, se obtienen resultados cualitativos (Sensible, Intermedio o Resistente). Con el segundo método, cuantitativo, podemos obtener la concentración mínima inhibitoria (CMI).

Si estos métodos ya estaban descritos desde hace mas de 50 años ¿en que se ha avanzado?

Técnicamente se han diseñado dispensadores de discos, replicadores, pipetas multicanal etc. hasta automatizar los antibiogramas. Pero opino que tiene mas importancia la normalización de los discos (material, tamaño, carga, humedad..) el medio de cultivo, el inóculo, condiciones de incubación, lectura e interpretación. Los controles de calidad son muy estrictos y existen comités, sociedades científicas y organismos (NCCLS, MENSURA..) que constantemente fijan la “doctrina”.

Conceptualmente, la observación crítica del antibiograma, tanto el cualitativo como el cuantitativo ha dado a conocer numerosos fenómenos de resistencia, sinergismos mecanismos de acción, dinámica de poblaciones, selección de mutantes etc..

Metodológicamente en estos últimos años la principal aportación en mi opinión es el de E-test®. Y opino así porque en estos tiempos uno espera que nos deslumbren con sofisticados aparatos y sin embargo este método por sencillez, originalidad y eficacia raya lo genial. Sintetiza el método cualitativo y el cuantitativo en una modesta tira que se maneja de forma parecida al disco de papel.

El Epsilon test® comercializado, consiste en una tira de plástico especial con una escala que incorpora el antimicrobiano en un gradiente de concentración correspondiente a 15 diluciones (marcadas en escala). La tira se coloca sobre la superficie previamente sembrada con el patógeno problema y se incuba. El antibiótico difunde en relación a su concentración, leyendo finalmente una zona de inhibición elipsoidal. La CMI vendrá dada por el punto de la escala en el que el extremo de inhibición intersecciona con la tira.

De esta forma, en una sola placa se puede obtener la CMI de varios antibióticos y, como en el método disco placa, un cuidadoso observador puede deducir fenómenos de interacción (sinergismos, antagonismos) tipos de resistencias, colonias en el halo de inhibición, contaminación etc.